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举个栗子:微生物学的兴起,从变酸的葡萄酒开始?

日报 举个栗子 3年前 (2017-11-14) 538次浏览 0个评论 扫描二维码

举个栗子:微生物学的兴起,从变酸的葡萄酒开始?

作为生态系统的重要组成部分,微生物维持着地球生命的基础生存环境,使碳、氮等重要元素重新进入生命循环。但是,今天的我们也很清楚地知道,某些微生物是威胁人类健康的大敌,正是它们引发了霍乱、伤寒、梅毒、肺结核等赫赫有名、让人避之唯恐不及的急性或慢性传染病。
早在 1676 年,列文?虎克率先观察到了自然界中的微小生物,并写出人类史上第一本关于微生物的专著——《列文?虎克发现的自然界的秘密》。但是,无论是他本人还是当时的西方学术界,多将之看作是自然界的一种奇观,甚至是上帝创造生命的一种证据——这些微小的生物似乎是由自然界自发产生的。直到巴斯德关注发酵现象后,这些神奇的小生物才一步步地从一种有趣的奇观,转变为人类的朋友或需要与之进行对抗的敌人。
恼人的酸味

1854 年,年轻的巴斯德因其在酒石酸晶体旋光性研究上所表现出来的超人才智,被任命为法国里尔理学院的院长。当时的里尔正成长为一个重要的工业城市,酿酒业是当地的重要产业。在巴斯德任职期间,里尔的酿酒业时常被酒精质量问题困扰,酒中总是带有一种不合宜的酸味。1856 年 11 月,当地工业家比戈先生前来寻求巴斯德的帮助,原因据说是他的儿子十分崇拜巴斯德。

酿酒的关键过程——发酵,早已为人们熟知,并被广泛应用。我们许多食物的生产过程都和发酵关系密切,如馒头、面包、酸奶等等。人类历史上充满了对发酵的玄想,几乎每个时期的时髦理论都用来解释过发酵现象。比如著名的笛卡尔就曾说过,“发酵是一种可混合和可移动的力的作用。”不要问我这句话究竟想表达什么意思,它唯一能告诉我们的就是,那时物理力学的地位十分显赫。第一个真正揭示了酒精发酵基本秘密的人,是发现氧的拉瓦锡。他将代数引入化学研究,创建了今日大家熟悉的化学方程式,同时也将精确性引入了化学,意义十分重大。拉瓦锡研究了酒精、糖以及氧的关系,最终将酒精发酵总结为糖的分解,并给出了漂亮的方程式。但是奇怪的是,虽然拉瓦锡不得不将酵母加入糖中使其发酵产生酒精,但在他严谨的定量化学方程式中,酵母是个多余的或者一个无法处理和理解的怪物。他倾向于无视酵母,并且有充分的理由,因为在发酵后期,伴随着酒精的产生,酵母消失了。
无论如何,酵母是酒精发酵研究中的乌云,类似于相对论革命前飘荡在物理学上空的乌云。修补拉瓦锡结论的说法纷纷出笼,比如当时德国的权威化学家李比希就认为酵母十分重要,确切的说,是酵母的消失十分重要。他认为正是酵母的分解使发酵得以发生,由此他构建了一个理论,认为分解中的酵母将它的分解状态传递给了糖,从而引发了糖分解为酒精。而瑞典化学家雅各布?贝采利乌斯则将酵母视作某种我们今日称为“催化剂”的物质,通过接触引发糖分解,不过他将酵母看作是一层活性氧化铝沉淀。这个观点所隐含的合理猜测部分,被后续的研究者加以发展,成为现代酶学的前身。
当时关于发酵的解释众说纷纭,但无人认识到酵母是一种有生命的微生物,它主宰着发酵的最终结果。因此所有这些理论都无法帮助比戈先生除去他酒中的酸味。
显微镜与化学

有趣的是,巴斯德赖以成名的酒石酸就是发酵的产物。他的故乡是著名的法国葡萄酒产地,因此巴斯德对酿酒的程序并不陌生,但也仅止于此,毕竟他从来没有真正研究和关注过发酵本身。接受了比戈先生的请求后,巴斯德在糖厂的一间地下室建立了一个简陋的实验室。为了研究神秘的酵母和发酵间的关系,巴斯德创造性地将显微镜引入到他的化学实验室。这个举动十分奇特,即便在今天,显微镜也算不上化学研究中的正统工具。

然而,正是这一举动,使得巴斯德将显微镜的观察结果与化学分析的精确结果历史性地相互结合,使得化学与生物学的奇妙综合就此拉开序幕,最终开创了今日被我们称为生物化学这一新领域的先河。在那个黑暗、阴冷、潮湿的地下室中,经历数年的艰辛观察和化学分析,巴斯德瞥见了微生物的奥妙,也让他开始思索微生物与人类疾病的关系。而他此后的数十年人生,再也无法离开那些显微镜下展示的奇妙而微小的生命,他的研究生涯与它们紧密相联,人类在懵懂中惨败于微生物的命运由此发生天翻地覆的改变。实验当然非常艰辛,充满了挫折。回顾巴斯德当年写下的实验记录,笔记本上四处标记着:失败、失败、失败。但凭借他优秀的观察和分析能力,巴斯德发现了两个重要的现象,酵母的形状依发酵情况发生改变,在发酵正常时是圆形的,而发酵异常时则成为杆状。化学分析显示,杆状酵母出现得越多,酒精中的乳酸含量就越高,而乳酸正是让酒带有不合宜酸味的原因。反复实验,这种联系并非巧合,这不由得让巴斯德怀疑,发酵是一种生命现象,酵母应该是一种生命,就是它决定着最终的发酵产物。
这个观点在当时太激进了,他自己也深知这一点,如果草率地发表文章,恐怕只会让自己身败名裂。在酒精发酵领域,充斥了太多权威的结论以及太多的纷争。彼时巴斯德羽翼未丰,他可不想贸然陷入漩涡中心,因此他决定从并不热门的乳酸发酵作为突破口,在这里他可能遭遇的反对是最少的。现在,他首先需要无可辩驳的实验结果来证实酵母是一种生命。

酵母的秘密

繁殖是生命的基本特征,如果酵母真的是一种生物,那么它必然而且应该表现出这一基本特点。然而当时的观测手段十分简陋,而工业发酵的模式,并不是一个合适的实验模式。酵母通常在发酵后期消失,这个现象早已熟知,正是它误导了拉瓦锡和李比希。看来需要给酵母提供更好的环境,但此前并无人做过真正的微生物培养。回顾过去的文献,1843 年的一篇科学院报告给了巴斯德启发,报告称,乳酸抑制发酵,但可加入弱碱性的白垩溶液来避免。

巴斯德的创造性在这里得到充分发挥,他移植那层灰色的被雅各布?贝采利乌斯称为“活性氧化铝”的沉淀,在简化到极点的环境中培养它们,加入白垩来中和预料中的乳酸,加入糖促进发酵,然后最重要的是找到促进酵母繁殖的营养液。这种营养液必需清澈,以便显微镜观察,同时还必须富含营养以刺激酵母的繁殖。经过巧妙的类比推理,巴斯德决定使用啤酒,它清澈而富有营养,当然使用前必须过滤。条件已经具备,成果就此产生,巴斯德终于证实,乳酸发酵经由乳酸酵母产生,它的形状和大小都有别于常用于啤酒发酵或酒精发酵的酵母。

巴斯德将这些重要结果,汇集成《论乳酸发酵》的论文,于 1857 年 8 月公开发表。在论文中他提到,他不仅已经成功鉴定出乳酸发酵所需的酵母,而且还可以用适宜的营养液对其进行培养选种,一切就如同培育植物一样。这篇划时代的论文如今被公认为现代微生物学的诞生标志。不过,到此为止的成果,尚无法对比戈先生面临的困境提供真正的帮助。初步站稳脚跟后,巴斯德立即开始向著名的也是混乱不堪的酒精发酵“宣战”,他鉴定出酒精酵母生长所需的必要成分,详细观察到酒精发酵过程中的各种现象。至此,巴斯德一鼓作气提出重要假设,发酵所需的一切要素——温度、糖分等——都是帮助酵母繁殖的因素,发酵的本质应该归属生物学而不是简单的化学方程式。巴斯德进一步指出,使用啤酒酵母进行酒精发酵时,不会产生乳酸和醋酸。这些产物的出现,是由于受到乳酸酵母的意外污染。就这样,巴斯德找到了解决比戈先生请求的问题的答案。摆脱困境的方法很简单,先用高温杀死乳酸酵母,然后移植啤酒酵母。1860 年,巴斯德因其在发酵研究中的杰出贡献,法国科学院授予他实验生理学奖。从此,巴斯德开始毫不犹豫地将他的研究称为“生理化学”,也即今日生物化学的前身。
发酵知多少

此后巴斯德继续孤军深入,将他在乳酸和酒精发酵上所取得的洞见进一步扩展,研究范围十分广泛,包括那些恼人的或者令人厌烦甚至危险的各种腐败变质现象。他发现了醋酸菌是将酒精转变为醋的关键因素,但制醋业中普遍认为醋缸中的线虫才是制醋的重要因素。为此巴斯德设计了一个既简单又有说服力的演示实验,只需一条浸过醋酸菌的绳索,将酒精缓慢的从其上流过,滴到盆里的液体就已经变成了醋,这一过程甚至可以持续数天。事实上,因为醋酸菌生长在液体表面,最终将消耗完线虫所需的氧,因此醋缸中的线虫通常会攻击醋酸菌,实际上被视为必不可少的线虫不仅和产醋毫不相干,反倒会阻碍醋的生产。

1861 年,在研究黄油变质的原因时,巴斯德观察到了丁酸弧菌,这是他在发酵研究中遇到的第一种会移动的微生物。限于基本的所谓动物植物常识,巴斯德喜欢将那些不动的酵母视作某种“植物”,因此他一度十分担心,会动的丁酸弧菌可能会像动物吃植物般将他希望寻找的黄油酵母作为食物吃掉。经过持续的观测和耐心的化学分析,他最终发现原来丁酸弧菌正是他想寻找的“黄油酵母”。不过,更重要的是,他发现丁酸弧菌是一种厌氧微生物,巴斯德超凡的观察能力和分析能力,在这里得到充分体现。他发现丁酸弧菌这种会运动的微生物在液体边缘处会停止移动,这是个很容易被忽视的细节;经仔细分析后,巴斯德猜测这是由于氧浓度的不同导致的结果。假设然后是精密设计的实验,使巴斯德发现了第一种厌氧微生物,要知道在当时氧对生命的重要性就和水一样被广泛认同。

这种新认识,促使巴斯德回头研究他已经非常熟悉的酵母,他发现某些酵母显然具有双重生存能力,即有氧和无氧生存,而多数时候发酵正是酵母无氧生存的结果,现在你明白为何在做酒或者做泡菜时要隔绝空气的道理了吧。厌氧微生物的发现,给巴斯德打开了一扇新的自然之门,他证实腐败是因为厌氧弧菌的存在,同时他认识到这种特殊发酵与地球生态循环间的深刻联系。1862 年,在致教育部长的信中,他写道:“在死亡之后,生命将以另一种形式和新的规律重新出现。地球表面生命永存的规律是:组成植物和动物的所有物质将被摧毁,并转化为气态的挥发性的和矿物等物质。”至此,在发酵研究领域,巴斯德当之无愧的成为世界第一人。

巴斯德灭菌法

当巴斯德在发酵领域一路高歌,顺带解决了争论许久的自然发生问题时,法国的葡萄酒贸易却陷入低谷。法国葡萄酒,直到今日依然大名鼎鼎,无可替代。不过,在法国和英国签署自由贸易协定的初期,名声在外的法国葡萄酒,虽然刚开始受到英国商人的热烈欢迎,但很快这项贸易就一蹶不振。一位因贩卖法国葡萄酒而几乎陷于破产境地的英国商人失望地写道“……一开始我们热情的欢迎法国葡萄酒,但不久以后这项贸易因葡萄酒的种种变质问题遭受巨大损失……”。关键时刻,拿破仑三世在副官的建议下正式委托巴斯德研究葡萄酒的发酵及变质问题,毫无疑问,他是最佳人选。不要忘记,巴斯德的故乡阿尔布瓦正是葡萄酒产地之一,因此巴斯德当即决定返回故乡,开始他的葡萄酒酿造及变质研究。葡萄酒的酿造时间短暂,一年只有一次机会。巴斯德带领三个学生,从 1863 年开始连续三个夏天呆在阿尔布瓦的实验室,研究分析葡萄酒酿造的工艺和保存手段及变质原因,为了保证葡萄的质量,他甚至专门购买了 100 平方米的葡萄园,雇人精心看守。他发现了通常被视为葡萄酒大敌的空气,明确的说是其中的氧,是促使葡萄酒变陈也即变得更加美味芳香的关键要素,这是个纯粹的化学过程,当然空气不能太多,过度氧化也会使葡萄酒变得难喝。而传统经验提示的尽可能避免与空气接触,其真正想避免的是黏附在尘埃中的微生物或寄生虫,这一点经历过自然发生论战的巴斯德自然非常清楚。
葡萄酒变质是个复杂的问题,红白葡萄酒各有其常见的变质现象。如红葡萄酒在变陈时易发生变淡最终变苦,而白葡萄酒则易发生脂肪样变质,使葡萄酒黏稠似油状液体。至于葡萄酒变酸则是在酿造时最容易发生的现象。巴斯德一步步揭示出引起这种种变质现象背后的原因:变酸通常是因为发酵过程受到醋酸菌的污染;变淡然后变苦是一种真菌样呈枝杈状寄生虫所引起;至于油状改变则是因为一种串珠状圆形真菌导致。1866 年巴斯德出版《葡萄酒研究》一书,将这些研究成果汇集在一起。
怎么解决葡萄酒的长期保存问题呢?巴斯德发明了著名的加热法——如今通常被称为巴氏灭菌法——直到今日依然在很多领域中广泛应用。方法非常简单,在隔绝空气的情况下,将葡萄酒在 60~100℃之间加热片刻。巴斯德对此做了精确的实验论证,无人敢于真正怀疑他的实验,但名酒制造商们却抵制加热法,认为即便加热能防止葡萄酒变质,但势必会严重破坏它的芳香和口味。为此,巴斯德要求成立一个委员会,检验他的加热法。委员会如期成立,包括巴黎的许多名流其中不乏名酒制造商,在葡萄酒比较品尝的盲法品尝中,人们确认只要按巴斯德的标准去做,加热几乎不改变葡萄酒的口味(不得不承认极少数人的味蕾非常厉害)。就此加热法的名声很快越过国界,传到新大陆,一位美国记者在纽约的《统计月刊》上写道,“巴斯德在葡萄种植者中的名声和总统一样大”。

尾声

巴斯德对发酵的研究,最终引领他走到了微生物与人类疾病的阿里巴巴山洞门前,由此引发了现代医学的猛烈革命,将传承自希波克拉底拥有数千年历史的传统西方医学颠覆。如果说巴斯德的前半生因驳斥自然发生说而名留青史,那么他的后半生持续不断的和守旧的医生们的激辩,对今日,每一个生活在阳光下的我们而言更有实际的利益。而他因此所遭遇的仇恨、敌视更远胜于其前半生,然而巴斯德无与伦比的观察和分析能力,配合杰出的实验设计,使每一个愿意承认事实的人折服。所有这一切,在研制狂犬病疫苗时到达了顶峰,作为一种病毒性疾病,在当时仅有显微镜的情况下,在根本不可能看见狂犬病毒的状况下,巴斯德正确判断出狂犬病必然由微生物引起,并成功研制出了疫苗。

(作者:三思逍遥)


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